J. of Taroten

16S rRNA遺伝子によるバクテリアの同定方法 (C2面:環境衛生工学, 2019.10.11)

MALDI-TOF MSや次世代シーケンサーもあるが‥

　16S rRNA遺伝子による菌種同定法について，非常に細かいPCR操作，あるいは，概念的な16S rRNAにもとづいた分類体系，といった情報はすぐに見つかるが，「どのキットを使うのか」「どこにシーケンスに出すのか」など実施上の手順がノウハウになって明示的に示した教科書がありません。臨床検査分野での 薬剤耐性菌 等の菌種同定にMALDI-TOF MSという質量分析手法が導入され，環境分野でも次世代シーケンサーの導入が進んだものの，従来の「単離コロニー → PCR → 電気泳動での産物の確認 → シーケンス」という手法も，依然，ある程度の重要性を保っています。いままで分子生物学的な菌種同定に手を出していなかったが，手を出してみたいという初心者の方へむけて，たろてんがここ半年で学んだ実施上の手順を書いてみた。

キットの使用は違和感もあり費用もかかるが割り切って使おう

　分子生物学方面の仕事にこだわりのある方も多く，キットを使うというと，「そんな得体のしれないものでは正しく測れていない」，「費用が高い」という方も多いが，「その方法でうまくいったのなら，そのキットは正しく機能した」，「キットなしで何度も失敗するよりは安い」と割り切って使うのでよいように思う。たとえば，コロニーからの抽出に「関東化学のDNA抽出試薬」,そのあとの16S rRNA遺伝子の増幅に「タカラバイオのBacterial 16S rDNA PCR」，そのあとのDNAの精製に「コスモバイオから発売のMonoFas DNA精製キット」などが使用可能である。シーケンスは京都大学内のマクロジェン・ジャパンに依頼となります。19:00までに東京都内の宅急便のセンターに持ち込めば，翌日午前中に試料が京大に到着し，その夜にはシーケンス結果が送られてくる。

(2021.3.10追記) マクロジェンジャパンの事務所が京都大学から東京湾岸部に移動しました。また，たろてんの研究室では，タカラバイオの16S rRNA増幅キット使用をやめ，プライマーなどをバラで買って，組み合わせ使用しています。また，関東化学のDNA抽出試薬が一部，使用できない菌種があるため，別の抽出法を使用することもあります。ただ，一連の操作に慣れるには，上記の簡易なキットでまず試すのもいいと思います。

コロニーごと同定を依頼する問題点

　以上の同定方法でキット，外注シーケンスを使うと1試料あたり3000円ほどかかるが，「単離コロニー → PCR → 電気泳動での産物の確認 → シーケンス」を一括して外注したらどうなるのか。前述のマクロジェン・ジャパンでは8000円だという。MALDI-TOF MSによる同定はもっと安くて5000円くらいでやってくれるところもある。ただ，PCR産物を数十μL送るのであれば，仮に輸送中に容器が破損しても，感染性もないし，臭気を発生することも，他の荷物の価値を毀損することもないが，コロニーの形態で送るとなれば，非常に低いとはいえ一定のリスクがある。さらに客観的なリスクとは別に，冷蔵品，冷凍品の宅急便は食品の輸送に使われていることが多く，一般の宅配便ユーザーから見て，いくら厳密に梱包されていても，一緒に微生物が送られるのは非常に気持ち悪く，また，正直に中身が書かれていたら，宅配便業者が引き受けを拒否する。その点，PCR産物の輸送であれば，情報を輸送しているのとほとんど変わりなく，常温での輸送も可能である。

シーケンス外注の仕方

　16S rRNA遺伝子のPCRでは，27Fと1492Rのプライマーセットで可変領域V1-V9を含む約1500bpを増幅する(タカラのキットを使った場合に，本当にそのプライマー配列が27Fと1492Rなのかは明示されていない)。そして，PCR産物に対して，シーケンス用プライマー518Fで1492R方へ(V4-V9)，800Rで27F方へ(V1-V4)，それぞれ中央部から両端部に向けて1菌株あたり2反応依頼する。800Rで得られた配列は，相補的にしたうえで順序をひっくり返して，518Fで得られた結果と重複部分を除いて結合し，約1500bpの配列にする。

　一方，次世代シーケンサーでは，数百塩基の領域を多数読むことが一般的であるため，V3-V4, V4, V4-V5, V5-V6 の領域を読むことが一般的です。シーケンス機械に対応した特殊なプライマーが必要なので，DNA抽出からPCRまでを研究室で実施する場合に，PCRのプライマーをシーケンス業者から送ってもらう方法が初心者には使いやすいだろう。


相同性検索サービス

　得られたシーケンス結果に対する相同性検索はオンラインで行う。DDBJ のBLASTで検索するのでもよいが，NCBIや 米国ミシガン州立大のRibosomal Database Project の方が基準株に絞った検索が容易で，結果の系統表示が見やすい。さらに，学生が「こっちのほうがいい」と使っているのが，病院の臨床検査室などが使っているという EzTaxon-e。また，微生物の分類記載上の注意として，微生物の分類体系に頻繁に変更があるので注意が必要です。

遺伝子による同定は歯切れがよい

　ここに書いた内容より，もっといいキットやもっといい外注先，もっと適切なデータベースをご存知の方もいらっしゃるだろうし，試料数などに応じて，より最適なサービスもあると思います。また，16S rRNA遺伝子に代わる微生物同定法が主流になるときも来るかもしれなせん。いずれにしても，APIなどの代謝パターンから菌種を同定するのに比較して，遺伝子による同定は歯切れがよくて気持ちよいのは確かです。同定のためのシーケンスであっても，論文投稿にあたっては，公的データベースへの登録が必要な場合も多いです。